小鼠單抗腹水的制備方法以及佐劑在腹水制備中的應(yīng)用

1975 年，Kohler和Milstein發(fā)表了“分泌預(yù)定特異性抗體融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”的著名論文，具有劃時(shí)代意義的新技術(shù)：單克隆抗體(McAb)技術(shù)從此問世。各種用途的單克隆抗體可用不同的方法獲得，包括小鼠單抗腹水制備或通過各種雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在體外生產(chǎn)。如下圖：

 小鼠腹水制備單抗是一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)的常用方法，主要用于生產(chǎn)科研或診斷用的單克隆抗體，是一般用途的單克隆抗體制備的方法。腹水中的單克隆抗體的濃度可達(dá)5~20mg/ml，是體外培養(yǎng)法的100~1000倍左右，是目前常使用的方法。

小鼠單抗腹水技術(shù)是通過將雜交瘤細(xì)胞接種至BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，利用其腹腔作為天然生物反應(yīng)器，促使細(xì)胞增殖并分泌單克隆抗體的方法。產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)成本低，無需復(fù)雜設(shè)備，抗體在生理微環(huán)境中分泌，折疊正確且糖基化完整，活性更接近天然抗體。腹水制備單抗可以支持難培養(yǎng)細(xì)胞株。

1. 選擇免疫動(dòng)物

在制備小鼠單克隆抗體腹水時(shí)，動(dòng)物的選擇很重要，?BALB/c小鼠為常用品系，因其與大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞具有遺傳相容性，BALB/c小鼠1923年育成，毛色為白色，BALB/c小鼠形成了許多亞系，如BALB/cAnN，BALB/cJ和BALB/cCd。乳腺癌發(fā)病率低，但對(duì)致癌因子敏感，血壓較高，多有心臟損害，兩性常有動(dòng)脈硬化，對(duì)放射線極度敏感。常用于單克隆抗體和免疫學(xué)研究。BALB/c小鼠生產(chǎn)性能好，繁殖期長，一般無相互侵襲習(xí)性，比較容易群養(yǎng)。

優(yōu)選8～12周齡成年鼠，體重需達(dá)18～20g以保證腹腔容量。老年鼠（如10月齡以上）會(huì)因代謝減緩而會(huì)影響腹水產(chǎn)量。雌性小鼠較常使用，因其腹腔空間較大且攻擊性較低。

2. 處理動(dòng)物

通過目測和體重監(jiān)測篩選健康個(gè)體，對(duì)小鼠進(jìn)行病原體檢測，排除鼠痘病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒等病原體感染，實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行7天環(huán)境適應(yīng)，觀察進(jìn)食、排泄及活動(dòng)狀態(tài)。在腹腔注射雜交瘤細(xì)胞之前，需先用石蠟油、降植烷或小鼠單抗腹水制備專用佐劑先處理小鼠，腹腔注射，0.5mL/只小鼠，處理腹腔15天左右，一般12～18天的預(yù)處理期，期間監(jiān)測小鼠健康狀態(tài)。小鼠單抗腹水制備專用佐劑預(yù)處理小鼠腹腔，可引發(fā)腹腔內(nèi)輕度炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞聚集，形成富含營養(yǎng)的微環(huán)境，這種環(huán)境更有利于雜交瘤細(xì)胞定植并持續(xù)分泌抗體。佐劑在腹腔內(nèi)形成油性基質(zhì)，延緩雜交瘤細(xì)胞被免疫系統(tǒng)快速清除，從而延長細(xì)胞存活時(shí)間，增加抗體積累量，預(yù)處理后的小鼠腹腔能支持雜交瘤細(xì)胞高效增殖，產(chǎn)生的腹水量可達(dá)到未處理小鼠的1.5～2倍，同時(shí)抗體效價(jià)顯著提升。佐劑預(yù)處理后可降低腹腔內(nèi)原有細(xì)胞成分的干擾，使后續(xù)離心純化時(shí)更容易分離出高純度抗體。實(shí)驗(yàn)室有條件的情況下，建議用小鼠單抗腹水制備專用佐劑制備小鼠單抗腹水。

疫動(dòng)物

小鼠單抗腹水制備專用佐劑預(yù)處理完小鼠腹腔后，注射雜交瘤細(xì)胞，建議每只注射80萬～100萬個(gè)。腹水會(huì)比普通佐劑晚出1.5天～2天，但通常情況下相同細(xì)胞株腹水的量是普通方法產(chǎn)出量的1.5倍左右，個(gè)別細(xì)胞株能到2倍以上且單抗腹水效價(jià)一般保持不變，相當(dāng)于抗體產(chǎn)量增加50%-100%。

4. 收獲腹水

用一只手抓取并固定小鼠，繃緊腹部皮膚，另一只收將針頭刺入腹腔1～2cm，針頭刺入時(shí)應(yīng)西安則左下腹或右下腹，避開上腹部的重要臟器和腹中線的大血管。抽取腹水。若操作中出現(xiàn)問題，可以參考以下解決辦法：

（1）若小鼠有大量的腹水但是無法流出，可以將針頭緩慢地旋轉(zhuǎn)，或換一個(gè)位置插入。

（2）若沒有腹水積蓄且小鼠的健康狀況尚好，可以重新注射細(xì)胞。

（3）若沒有腹水積蓄且小鼠死亡(尤其是在注射后2周內(nèi)發(fā)生死亡)，下次注射時(shí)減少細(xì)胞的量。

（4）若形成了實(shí)體的腫瘤，將腫瘤細(xì)胞打散、重懸，并用以注射另一只小鼠單抗腹水制備專用佐劑預(yù)處理的小鼠。

（5）若只形成了少量的腹水，將其注射另一只預(yù)處理的小鼠（約0.5mL/只）。

（6）室溫下，1500g離心腹水10min。若液體在離心管內(nèi)凝結(jié)，在離心前用細(xì)木棒在凝塊與離心管壁間刮一圈，若凝塊附在木棒上則將其丟棄，否則不做處理，離心后凝塊將成為沉淀的部分。

（7）取上清，棄沉淀。在所有腹水收集完之前將先離心得到的腹水保存于4℃(不超過1周)。

5. 檢測腹水效價(jià)

  可用ELISA法檢測腹水效價(jià)。

補(bǔ)充：小鼠抓握的方法

小鼠通常比較溫順，但被激怒后也會(huì)咬人。正確的操作會(huì)讓它們更加溫順。

（1）用手溫柔地抓住小鼠的尾巴，將其從籠中取出。將動(dòng)物放置在籠蓋的柵欄上，向后輕微的牽拉尾巴。避免用噪聲和猛烈動(dòng)作激怒動(dòng)物。如下圖：

（2）用另一只手的拇指和食指從后頸部抓住耳后皮膚。將尾巴從優(yōu)勢手移出來，用另一只手的小指壓住。

（3）觀察或注射動(dòng)物。