小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定ELISA試劑盒原理及應用

一、小鼠單克隆抗體及用途

1、什么是單克隆抗體

在動物體內，抗體主要由漿細胞合成，漿細胞是一種終末分化的B淋巴細胞，因為漿細胞不能在組織培養中生長，所以不能用作體外抗體的來源，K?hler 和Milstein在1975年開發了一種技術，該技術可以使分泌具有明確特異性的抗體的細胞克隆群生長。從免疫動物中分離出的抗體分泌細胞與骨髓瘤細胞(一種B細胞腫瘤)融合。這些雜交瘤細胞可以在體外維持生長，并持續分泌具有特定特異性的抗體。由雜交瘤產生的抗體被稱為單克隆抗體。

2、為什么選擇小鼠作為單抗來源

常用于制備單克隆抗體的實驗動物包括小鼠、大鼠、亞美尼亞倉鼠和兔。其中常用的免疫接種對象是小鼠，來自BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞是良好的融合細胞，絕大多數單克隆抗體來源于小鼠細胞，小鼠易于獲得遺傳背景一致的近交系品種、飼養成本低、易操作；其次，有很多試劑可用于檢測小鼠免疫球蛋白；另外，小鼠對外來蛋白質能產生良好的免疫應答，致敏淋巴細胞與多種鼠源骨髓瘤細胞系能夠發生有效融合。

3、小鼠單克隆抗體的特點

小鼠單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的均一性抗體，其核心特性在于能夠高特異性識別并結合特定抗原表位，且同一批次抗體分子結構完全一致，呈現出納摩爾級高親和力。然而，小鼠單克隆抗體的高度特異性也導致其易受抗原表位變異影響而失效，且傳統雜交瘤技術需經歷數月的細胞培養、克隆篩選及驗證流程，成本高昂且技術門檻較高，阻礙了其在快速突變病原體或復雜表位靶點中的應用廣度。

    多克隆抗體                                      單克隆抗體

4、小鼠單克隆抗體的用途

小鼠單克隆抗體是強大的免疫化學工具，已成為在生物醫學及工業領域應用廣泛、較有價值的生物大分子。雜交瘤技術的發明及單克隆抗體的生產為科研工作帶來了很大的改變，為其提供了無限量的、獨特的單克隆抗體試劑，用于特異性抗原的識別、分離、清除、活化或檢測等。

二、小鼠單克隆抗體Ig類、亞類、κ型和λ型

1. 小鼠單克隆抗體Ig類：依據重鏈C區的理化特性及抗原性的差異，小鼠單抗Ig類可分為IgG，IgM，IgA，IgE和IgD 五大類，重鏈分別為γ，μ，α，ε，δ，重鏈決定免疫球蛋白的種類。

2. 小鼠單克隆抗體Ig亞類：亞類是根據重鏈恒定區的微細結構、二硫鍵的位置與數目及抗原特性的不同進行區分的。小鼠的IgG有IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3 四個亞類，小鼠IgA、小鼠IgM、小鼠IgE和小鼠IgD未發現亞類。

3. 小鼠單克隆抗體Ig的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型：根據輕鏈恒定區的抗原性不同，小鼠單克隆抗體Ig的輕鏈分為κ（Kappa）和λ（Lambda）兩個型。任何種類的免疫球蛋白均有兩型輕鏈分子。

三、為什么要對小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定

目前，雜交瘤單克隆抗體技術的應用日益廣泛和深入。小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型的鑒定對McAb的進一步研究具有十分重要的意義。

單克隆抗體的不同類/亞類/亞型在結構上有所區別，其免疫源性與在體內發揮的作用存在差異，在生物體內具有不同的功能效應，因此在篩選雜交瘤時需要確定高表達量的陽性克隆是否是所需要的類/亞類/亞型分子，而且，明確抗體的類/亞類/亞型有助于選擇更加合適的抗體純化方法，能夠大大提高抗體獲得率，對抗體進行進一步的細分，并進行抗體類/亞類/亞型鑒定，對于疾病作用機理的研究和抗體藥物的開發，均有重要意義。

不同類/亞類/亞型抗體在抗體結構（例如Fc區結構、是否以多聚體形式存在等）及功能上（例如補體激活、半衰期等）也有所區別，進行抗體亞型鑒定能夠更加清楚的了解手中抗體的結構及功能，從而更好的應用于下游實驗。

四、小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定的方法

小鼠單克隆抗體 Ig 類/亞類/亞型的鑒定方法多樣，涵蓋血清學方法、免疫電泳、ELISA 、膠體金以及分子生物學方法等。在這些方法里，ELISA 鑒定法較為常用。該法靈敏度較高，即便是極微量的單克隆抗體也能夠精準檢測出來。操作相對標準化，易于實現自動化流程，十分契合大量樣本的快速檢測需求。檢測結果可借助儀器精確讀取數據，進而開展定量分析，所獲數據客觀可靠，能夠為研究和應用提供堅實有力的支持 。

五、小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定ELISA試劑盒原理

小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定ELISA試劑盒利用雙抗體夾心法鑒定小鼠淋巴細胞雜交瘤培養上清中單克隆抗體或特異親和純化單克隆抗體的類和亞類（可區分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA\Kappa\Lambda）。采用小鼠抗體共有位點的二抗包被微孔板，與加入的培養上清中的小鼠抗體結合，再加入HRP標記的抗小鼠各類、亞類、亞型的抗體來分別反應， 隨后用TMB底物系統顯色并用稀硫酸終止，再通過酶標儀檢測吸光度來判斷被測單克隆抗體的類或亞類。ELISA試劑盒具有極高的分辨率，是鑒定小鼠單克隆抗體類、亞類、亞型的可靠工具。

 雙抗體夾心法（Ab，抗體；Ag，抗原（小鼠抗體）；E，酶）

六、小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定ELISA試劑盒鑒定步驟

 1、先將試劑盒恢復室溫（大約30分），然后用純水把清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。

 2、取出酶標板。每個標本需要8孔，陽性對照8孔，陰性對照8孔。多余的用自封袋保存，記得放入干燥劑。

 3、將標本檢測孔每孔先加入標本稀釋液各50μl。然后將50μl細胞培養上清（或特異親和純化的抗體）再加入酶標微孔板，每個標本加8孔；陽性對照和陰性對照各8孔每孔100μl此處不加標本稀釋液。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。

 4、棄去板內液體，手工洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干（或機洗5遍）。再在每個標本的8孔中分別加入8種酶標二抗各100μl，通用陽性、陰性對照的各孔也一樣。在加樣圖上或酶標板上做好標記。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。

 5、吸棄板內液體，手工洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干（或機洗5遍）。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鐘。

 6、本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結果，看顯色藍的那個孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。更可將反應終止液（每孔50μl）終止反應后用酶標儀450nm測定波長，630nm參考波長雙波長測定結果，參看高值孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類亞型(陽性對照OD一般不小于0.8，陰性對照一般不高于0.15，陽性判定標準：樣品OD大于陰性OD+0.15，陰性OD低于0.05按0.05算)。

七、試劑盒的選擇

1. 如果不需要對小鼠單克隆抗體Ig 的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型進行鑒定，可以選擇小鼠單克隆抗體Ig類/亞類鑒定試劑盒鑒定，鑒定步驟同上。如果同時需要對小鼠單克隆抗體Ig 的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型進行鑒定，則應選擇小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定ELISA試劑盒進行鑒定。

2. 小鼠單克隆抗體Ig類/亞類鑒定試劑盒、小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定試劑盒主要用于小鼠淋巴細胞雜交瘤培養上清中單克隆抗體或特異親和純化單克隆抗體的類、亞類、亞型的鑒別。

3. 在檢測腹水類單抗時要稀釋到1/5萬，雖然小鼠單克隆抗體Ig類/亞類鑒定試劑盒、小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定試劑盒也能分辨，但是由于此類樣品成分十分復雜，有干擾結果的可能，這種情況下建議選擇小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定酶標二抗即用套裝進行鑒定。同時也可以使用抗原包被板替換試劑盒內的包被板來解決此類問題，但這種情況下陽性對照不顯色屬于正常。

4. 選擇小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定酶標二抗即用套裝進行鑒定時，很多試劑是需要自己準備的，如果感覺麻煩，可選擇小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定試劑盒進行鑒定。將會帶來非常滿意的試驗結果。

八、注意事項

1. 手洗板子時一定要把孔加滿，停留10秒然后棄盡，甩干凈。特別是在酶標二抗溫育后洗板時一定要把酶吸出而不是甩出，要吸凈。這個在手工洗板時對結果很重要。

2. 一次沒用完的板子要帶干燥劑放自封袋封好，隨盒存放。

3. 拿放板子時不要劇烈抖動，以免孔間交叉污染出現錯誤結果。

4. 本試劑一般不會出現兩個陽性，但出現兩個陽性的現象現實中是真實存在的，一般會一個OD很高，另一個很低但卻還能判為陽性，實驗分析表明這種情況下以OD高值孔為準，出現這種情況有多重原因：A、培養的細胞中有“飼養細胞”殘留；B、由于單抗研制存在人工干預步驟因此抗體本身有可能會存在亞類結構上的輕微變異； C、樣品為非特異親和純化的抗體或樣品是腹水；D、上清出現少量污染；E、實驗操作粗放；F、加錯試劑。

5. 在使用小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定酶標二抗即用套裝鑒定時，過于在強光或不良環境中頻繁開啟管蓋有可能因此使效期縮短，顯色必須使用TMB系統。