BIOTIN快速標(biāo)記試劑盒 產(chǎn)品說明書

 在您使用本產(chǎn)品前請認(rèn)真閱讀說明書，這對您順利完成實(shí)驗(yàn)很有幫助。

產(chǎn)品貨號：6213-50MG

產(chǎn)品名稱：BIOTIN快速標(biāo)記試劑盒

原理與應(yīng)用：本試劑盒提供有預(yù)活化的生物素BIOTIN---NHS，適用于帶有游離氨基的物質(zhì)的標(biāo)記，比如：帶有游離氨基（伯胺）的抗體、蛋白或者化合物。本試劑盒采用特有穩(wěn)定技術(shù)，活化的BIOTON穩(wěn)定保存在液體中，吸取使用方便，同時(shí)試劑盒組成、配方和操作力求兼顧和優(yōu)化，讓您的標(biāo)記工作變得簡單且更易把控和操作！和其它試劑盒不同，本試劑盒還額外增加了標(biāo)記后標(biāo)記效果所有核心試劑與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

試劑盒組成：

操作步驟：

1. 從4℃取出BIOTIN快速標(biāo)記試劑盒，恢復(fù)室溫（一般15分鐘左右）。

2. 首先要去除待標(biāo)記抗體或蛋白中的含有氨基的緩沖成分物質(zhì)，比如甘氨酸、Tris 等，可采用透析和超濾（透析袋和超濾管選擇參考附件3）的辦法置換緩沖液，以去除干擾物質(zhì)達(dá)到好的標(biāo)記效果！透析或超濾使用待標(biāo)記物處理液進(jìn)行（將待標(biāo)記物處理液干粉充分溶解于純水即可，每袋配1L無需調(diào)節(jié)PH。配好可存放于4℃，3-6個(gè)月內(nèi)用完），超濾的話先加上蛋白同體積的標(biāo)記物處理液再進(jìn)行超濾，第2次后每次加2倍原蛋白體積的待標(biāo)記物處理液，通常超濾4次即可（遇到溶解度較低的蛋白超濾時(shí)可能因?yàn)檫^于濃縮而產(chǎn)生聚集堵塞影響超濾，這一類蛋白建議透析），透析的話每次50X-100X體積，一共4次，每次不低于2小時(shí)，也可過夜（12小時(shí)），過夜時(shí)請盡量100X以上體積，透析請?jiān)?℃冰箱進(jìn)行，另外注意使用攪拌透析可以按2小時(shí)一次節(jié)省時(shí)間。

3. 然后將抗體或蛋白的濃度調(diào)整到2mg-5mg/mL之間，其它濃度也行但是會影響標(biāo)記體積，需要注意其對耗材以及緩沖液使用規(guī)格與量的影響。

4. 按照每取100ul抗體加標(biāo)記啟動液1.5ul后混勻，再按照每取1mg抗體或蛋白加活化BIOTIN 20ul,加完后迅速混勻開始進(jìn)入標(biāo)記過程，避光37℃ 2小時(shí)反應(yīng)徹底。

5. 反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行超濾或透析（透析袋和超濾管選擇參考附件3），超濾或透析請使用與要保存的保存液一致的緩沖液進(jìn)行，推薦使用0.01M PBS（PH:7.0，無需調(diào)PH的經(jīng)驗(yàn)配方見附件2），一般超濾的話需要每次反應(yīng)體積兩倍的緩沖液，通常超濾6次即可（超濾溶解度較低的蛋白時(shí)一定要注意，可能由于離心濃縮造成部分聚集此時(shí)建議透析更科學(xué)），透析的話每次50X-100X 體積，一共4次，每次不低于2小時(shí)，也可過夜（12小時(shí)），過夜時(shí)請盡量100X以上體積，透析請?jiān)?℃冰箱進(jìn)行，另外注意使用攪拌透析可以按2小時(shí)一次節(jié)省時(shí)間。

6. 透析結(jié)束可以加上防腐劑或保護(hù)蛋白（防腐劑推薦0.1%NAN3或者0.1%PROCLIN-300,蛋白一般選擇BSA，如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)加蛋白有風(fēng)險(xiǎn)請慎重）。如是超濾，超濾結(jié)束請用0.01M PBS（PH:7.0，無需調(diào)PH的經(jīng)驗(yàn)配方見附件），按每毫克蛋白補(bǔ)足到0.5ml終體積即可，防腐劑添加量同透析。一切完畢后標(biāo)記物建議-20℃保存，也可以短期4℃存放。

7. 標(biāo)記后標(biāo)記效果測試（請注意標(biāo)記后不需要透析或超濾即可吸出部分標(biāo)記物同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記效果測試）：建議將標(biāo)記物用0.01M CB,PH:9.6緩沖液進(jìn)行包被微孔板，包被請采用倍比包被，12孔條首孔包被濃度2ug/ml（按投料的蛋白和體積計(jì)算濃度），第二孔1ug/ml以此類推每孔100ul，一共倍比包到12孔就好。37℃包被2-3小時(shí)或者4℃過夜都可以，包被結(jié)束用PBST洗一遍拍干（切記一定要洗一遍），然后加入HRP-SA工作液100ul/孔，37℃溫育30分鐘。溫育結(jié)束PBST洗板5次并拍干，加TMB顯色液100ul/孔，37℃溫育顯色20分鐘，顯色結(jié)束觀察或打?。@色結(jié)束加50ul/孔 2M H2SO4終止，酶標(biāo)儀單波長450nm讀數(shù)或者雙波長450nm/630nm與450nm/630nm讀數(shù)）。不顯色說明沒有標(biāo)記上，顯色說明標(biāo)記上但不同蛋白標(biāo)記后效果有所不同,一般大多數(shù)蛋白在標(biāo)記后按蛋白計(jì)包被濃度在16ng/ml時(shí)，也就是包被1.6ng/孔時(shí)（第8孔）,OD值在2.0左右（因各實(shí)驗(yàn)室ELISA條件和用液不同此結(jié)果僅供參考）。

注意事項(xiàng)：

1. 小分子藥物不建議直接標(biāo)記BIOTIN，BIOTIN標(biāo)記后的作用及其有限，這種情況建議先偶聯(lián)BSA以增加每個(gè)偶聯(lián)物分子中小分子藥物和BIOTIN的偶聯(lián)量，這樣效果會非常好。

2. 如果待標(biāo)記物含有其它蛋白需要把無關(guān)蛋白同樣計(jì)算進(jìn)去，盡快如此也請您慎重選擇這樣的樣品進(jìn)行標(biāo)記。

3. 本試劑盒保存4℃可以保證1年內(nèi)開啟有效，活化BIOTIN開啟后小心取用切勿污染堿性物質(zhì)和含氨基物質(zhì)，雖然此試劑盒中它被保護(hù)的很穩(wěn)定但為了避免意外發(fā)生也盡可能在有效期內(nèi)的3個(gè)月內(nèi)用完。

4. 注意透析袋為贈品數(shù)量不能支持無限次數(shù)的標(biāo)記，僅支持大體積為20ML的蛋白的一次性標(biāo)記，更多次更微量的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)請參考附件3使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的合適的透析袋或者超濾管進(jìn)行。

5. 本試劑盒是按蛋白50mg足量標(biāo)記BIOTIN 2倍的量準(zhǔn)備和使用的活化生物素，是為了涵蓋客戶各種情況也能盡可能的確保標(biāo)記的成功率。也就是說使用中可以根據(jù)實(shí)際情況減少到說明書操作要求的1/2的BIOTIN用量(比如1MG生物素標(biāo)記可以標(biāo)記20MG的蛋白也能取得較為理想的結(jié)果），減少后可以標(biāo)記更多的蛋白。標(biāo)記試劑盒還可以支持標(biāo)記量100ug的蛋白標(biāo)記。

附件：

1. 0.01M  CB ，PH:9.6緩沖液配制：取NaHCO3, 0.67g和Na2CO3, 0.21g加水到1L溶解完全即可，不用調(diào)節(jié)PH。

2. 0.01M PBS,  PH:7.0緩沖液配制：取NaH2PO4·2H2O，0.49g和Na2HPO4·12H2O, 2.39g以及NaCL，9g加水1L溶解完全即可，不用再調(diào)節(jié)PH。

3. 超濾管和透析袋的截留分子量選擇標(biāo)準(zhǔn):首先要小于蛋白分子量，原則上可以小不能大。建議在蛋白分子量的1/8-1/2之間選擇，比如蛋白分質(zhì)量160K,選擇20K-80K的截留量就好，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)使用較多的透析袋外部尺寸型號為：MD10和MD34，當(dāng)然也可以使用其它尺寸。

特別提示：如果您在實(shí)驗(yàn)過程中遇到任何困難，請?jiān)诩皶r(shí)聯(lián)系我們技術(shù)團(tuán)隊(duì)獲取支持。